Ślina jako materiał w diagnostyce nowotworów

Zachorowalność na nowotwory złośliwe wzrasta od lat 60-tych ubiegłego wieku. Choć stale wprowadzane są nowe strategie, umożliwiające ich leczenie nawet w zaawansowanym stadium, kluczową kwestią wciąż pozostaje diagnoza nowotworu na wczesnym etapie rozwoju. Poznanie pełnego genomu człowieka pozwoliło na identyfikację genów powiązanych z procesem karcynogenezy, czyli takich, których mutacje zwiększają ryzyko wystąpienia określonych nowotworów. Są to antyonkogeny, zwane też genami supresorowymi, geny mutatorowe (zaangażowane w proces naprawy DNA) oraz protoonkogeny. Każdy rodzaj nowotworu ma obecnie określony panel genów, które podlegają sekwencjonowaniu w celu poszukiwania ewentualnych mutacji mających związek z jego wystąpieniem. Do najważniejszych genów związanych z karcynogenezą należą TP53, P16, BRCA1, BRCA2, KRAS, SMAD4, WT1, CDKN2A, PTEN, KRAS, RB1 i VHL. Poza wykrywaniem mutacji specyficznych dla określonych typów nowotworów, nowoczesna diagnostyka onkologiczna obejmuje także oznaczanie białek, których ekspresja występuje w określonych nowotworach. Białka te traktowane są jako markery onkologiczne, a ich podwyższone stężenie (np. we krwi) wskazuje na obecność nowotworu w organizmie pacjenta. Konsekwencją transformacji nowotworowej jest też często biosynteza białek syntetyzowanych w okresie płodowym, takich CEA (ang. Carcinoembryonic antigen – antygen karcynoembrionalny). Dysponując próbką śliny badanego pacjenta możliwe jest także oznaczanie aktywności enzymów, których wzrost lub spadek aktywności katalitycznej sugerować może rozwój procesu nowotworowego. Postęp w dziedzinie technologii medycznych umożliwił wprowadzenie nowoczesnych metod diagnostycznych opartych na panelach biomarkerów występujących w ślinie pacjenta. Metody te okazują się pomocne w diagnostyce wielu chorób onkologicznych, takich jak rak płuca, rak piersi czy nowotwory regionu głowy i szyi. Ogólnie rzecz ujmując, w wykrywaniu zmian nowotworowych na podstawie badania próbki śliny, istotne jest oznaczanie biomarkerów proteomicznych, biochemicznych, jak i wykrywanie określonych mutacji genowych. Każdy nowotwór wykazuje odmienne cechy, stąd istotne z klinicznego punktu widzenia jest oznaczenie odpowiednich biomarkerów, charakterystycznych dla danego guza, co pozwoli na możliwie najwcześniejsze wykrycie zmian o charakterze złośliwym. 

Nowotwory regionu głowy i szyi 

Dzięki opracowaniu tzw. panelu metylacji całego genomu odkryto geny NID2 i HOXA9, które mogą być z powodzeniem używane jako biomarkery we wczesnej diagnostyce nowotworów głowy i szyi, takich jak płaskonabłonkowy rak jamy ustnej, czyli OSCC (ang. Oral squamous cell carcinoma). Za pomocą badania wykorzystującego próbkę śliny pacjenta możliwa jest identyfikacja mutacji somatycznych genów CDKN2A, PIK3CA, TP53, HRAS, NRAS oraz genów wirusa HPV (ang. Human Papilloma Virus – wirus brodawczaka ludzkiego). Wykrycie niniejszych mutacji genowych umożliwia diagnozę OSCC u 100% pacjentów z rakiem jamy ustnej oraz u 47-70% pacjentów z nowotworami o innej lokalizacji. Wykazano, że możliwe jest również oznaczenie nowotworowego DNA w ślinie pacjenta poddawanego leczeniu przed wystąpieniem klinicznych objawów nawrotu [1]. Ślina zawiera wolne cząsteczki DNA, z których 70% pochodzi od gospodarza, a pozostałe DNA – z flory bakteryjnej jamy ustnej. Co więcej, w ślinie występuje także EGFR, którego poziom może stanowić marker prognostyczny w określaniu rokowania [2]. W diagnostyce nowotworów jamy ustnej istotne są również cytokiny, tworzące mikrośrodowisko guza, czyli TME (ang. Tumor microenvironment). W ciągu ostatnich 15 lat badań wykazano, że nieprawidłowe stężenie cytokin w ślinie może stać się kolejnym biomarkerem we wczesnym wykrywaniu OSCC. Wyniki tych badań wskazują na znacznie podwyższony poziom interleukin IL-6 i IL-8 oraz sIL-2R u pacjentów ze zdiagnozowanym OSCC w porównaniu z osobami zdrowymi. Niestety, kwestia stężenia cytokin u pacjentów z podejrzeniem nowotworów złośliwych jamy ustnej nie została do końca poznana [3]. W diagnostyce raka jamy ustnej opisano natomiast udział białek ślinowych, takich jak P14, białko wiążące Mac-2, katalazę, CD59, defensynę 1 i profilinę 1 ze specyficznością diagnostyczną sięgającą 80% i czułością rzędu 90% [4]. Kwestia markerów ślinowych pojawia się również w diagnostyce płaskonabłonkowego raka regionu głowy i szyi (HNSCC – ang. Head and neck squamous cell carcinoma). Podobnie jak w przypadku OSCC, wykazano tu podwyższony poziom IL-6 i IL-8 w ślinie pacjenta, a ponadto odnotowano również wzrost ekspresji TNF-α. Ze względu iż cytokiny te regulowane są przez szlak sygnalizacyjny NF-κB (charakterystyczny dla procesów zapalnych) sugeruje to ich udział w progresji tego nowotworu. Dowiedziono również wzrost stężenia interleukiny IL-10 w próbkach pochodzących od pacjentów ze stwierdzonym HSCC. Pozostałe proponowane biomarkery w diagnostyce nowotworów głowy i szyi stanowią: dehydrogenaza mleczanowa (LDH), białko C-reaktywne (CRP), antygen CEA, Zn-α-2-glikoproteina, surwinina, peroksyredoksyna 2, białko S100A9 oraz szereg białek zaangażowanych w angiogenezę, w tym HGF, sHER2, PECAM-1, sIL-6Ra i receptor dla naskórkowego czynnika wzrostu, czyli sEGFR [5].    

Markery ślinowe w diagnostyce raka płuc 

Jak już wiadomo, niezwykle istotną rolę w diagnostyce onkologicznej opartej o badanie próbki śliny odgrywa oznaczanie poziomu określonych białek. Z tego też względu wykorzystuje się tu stosowane w proteomice metody instrumentalne, takie jak SELDI-TOF-MS (ang. Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry), czyli   powierzchniowo wzmocnioną spektrometrię mas z desorpcją/jonizacją laserową czasu przelotu. Technika ta pozwala na uzyskanie wyraźnego profilu proteomicznego u zdrowych osób stanowiących próbę kontrolną. Zastosowanie metod spektrometrii mas w kombinacji z dwuwymiarową elektroforezą żelową (2DE – ang. Two-dimensional gel electrophoresis) wykazuje obiecujące wyniki w wykrywaniu markerów dla raka płuc. Badanie to charakteryzuje się jednocześnie wysoką specyficznością i czułością [6].  

Równie ważną rolę, poza analizą proteomu pacjenta, odgrywa oznaczanie metabolitów śliny, zwłaszcza tych biorących udział w metabolizmie białek i peroksydacji lipidów. U chorych na raka płuc wykryto bowiem spadek aktywności aminotransferazy asparaginianowej (AST), wzrost aktywności aminotransferazy alaninowej (ALT) oraz obniżony współczynnik ALT/AST. Niestety, żaden z biochemicznych markerów nie może być stosowany w sposób niezależny we wczesnym wykrywaniu zmian nowotworowych płuc. Obecnie najbardziej przydatny zestaw ślinowych biomarkerów metabolicznych raka płuca stanowi wartość pH, kwas sjalowy, aktywność katalazy, stężenie anionów Cl^–, poziom koniugatów trienowych i zasad Schiffa oraz aktywność fosfatazy alkalicznej. Zastosowanie niniejszego panelu diagnostycznego zapewnia 69,5% czułości oraz 87,5% swoistości w wykrywaniu raka płuca. Za dodatkowe markery posłużyć mogą: EGFR, IL-10, haptoglobina, kalprotektyna, Zn-α-2-glikoproteina, CXCL10 (ang. C-X-C motif chemokine ligand 10) oraz mikroorganizmy z rodzaju Streptococcus i Veillonella [7]. 

Markery ślinowe w diagnostyce raka jelita grubego

Wyniki ostatnich badań sugerują możliwość wykorzystania biomarkerów ślinowych we wczesnym wykrywaniu zmian nowotworowych jelita grubego. Wykazano bowiem przydatność α-defensyny 1, chemeryny oraz czynnika TNF-α jako panelu markerów diagnostycznych w diagnostyce raka jelita grubego. Uważa się, że zarówno czułość, jak i specyficzność tej metody sięga 100%. Co więcej, niniejsze białka mogą być oznaczane zarówno w ślinie jak i w surowicy pacjenta [8]. Postulowana jest również diagnostyczna przydatność bakterii z rodzaju Fusobacterium nucleatum, których DNA wykrywane jest w ślinie pacjentów chorujących na ten właśnie nowotwór. Obecność DNA F.nucleatum stwierdzana jest głównie w obrębie guzów jelita grubego, nie występuje natomiast w okolicznych zdrowych tkankach, zwłaszcza w zaawansowanym stadium procesu nowotworowego. Wykazano, że F.nucleatum zaangażowany jest w procesy migracji i proliferacji komórek nowotworowych raka jelita grubego na drodze modulacji sieci molekularnej niektórych ścieżek sygnalizacyjnych. Wyniki badań potwierdzają podwyższone stężenie DNA tego mikroorganizmu w ślinie pacjentów ze zdiagnozowanym rakiem jelita grubego [9]. Ze względu na ten fakt, oznaczanie zawartości DNA F.nucleatum może być stosowane jako nieinwazyjny test przesiewowy w diagnostyce tego nowotworu.

Piśmiennictwo

[1] Kaczor-Urbanowicz K.E, Wei F, Rao S.L, Kim J, Shin H, Cheng J, Tu M, Wong D.T.W, Kim Y. Clinical validity of saliva and novel technology for cancer detection. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019; 1872(1):49-59. doi: 10.1016/j.bbcan.2019.05.007.

[2] Aro K, Kaczor-Urbanowicz K, Carreras-Presas CM. Salivaomics in oral cancer. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 2019; 27(2):91-97. doi: 10.1097/MOO.0000000000000502.

[3] Ferrari E, Pezzi M.E, Cassi D, Pertinhez T.A, Spisni A, Meleti M. Salivary Cytokines as Biomarkers for Oral Squamous Cell Carcinoma: A Systematic Review. Int J Mol Sci. 2021; 22(13):6795.

[4] Kaur J, Jacobs R, Huang Y, Salvo N, Politis C. Salivary biomarkers for oral cancer and pre-cancer screening: a review. Clin Oral Investig. 2018; 22(2):633-640. doi: 10.1007/s00784-018-2337-x.

[5] Amenábar J.M, Da Silva B.M, Punyadeera C. Salivary protein biomarkers for head and neck cancer. Expert Rev Mol Diagn. 2020; 20(3):305-313. doi: 10.1080/14737159.2020.1722102.

[6] Wang X, Kaczor-Urbanowicz KE, Wong DT. Salivary biomarkers in cancer detection. Med Oncol. 2017; 34(1):7. doi: 10.1007/s12032-016-0863-4.

[7] Skallevold H.E, Vallenari E.M, Sapkota D. Salivary Biomarkers in Lung Cancer. Mediators Inflamm. 2021; 2021:6019791. doi: 10.1155/2021/6019791.

[8] Waniczek D, Świętochowska E, Śnietura M, Kiczmer P, Lorenc Z, Muc-Wierzgoń M. Salivary Concentrations of Chemerin, α-Defensin 1, and TNF-α as Potential Biomarkers in the Early Diagnosis of Colorectal Cancer. Metabolites. 2022; 12(8):704. doi: 10.3390/metabo12080704.

[9] Zhang X, Zhang Y, Gui X, Zhang Y, Zhang Z, Chen W, Zhang X, Wang Y, Zhang M, Shang Z, Xin Y, Zhang Y. Salivary Fusobacterium nucleatum serves as a potential biomarker for colorectal cancer. iScience. 2022; 25(5):104203. doi: 10.1016/j.isci.2022.104203.